マウスのしっぽや耳の組織からのDNA抽出法【Proteinase K】

実験プロトコル

Proteinase Kを使ったジェノタイピング用のDNA抽出法のプロトコールを紹介します。

Proteinase K (プロテイナーゼ K)とは

1974年に、Engyodontium albumから抽出されたセリンプロテアーゼの一種です。

かなり強いタンパク質分解活性をもっており、核酸分解酵素も含めてタンパク質を分解するので、核酸抽出によく用いられます。

60℃、pH 8.0付近で最も高い酵素活性があり、95℃10分間で失活します。

プロトコール

まずProteinase Kを 20mg/mlの濃度で準備します。

Proteinase K用のバッファーを準備します。


最終濃度100ml当たり
1M Tris pH 8.010mM1ml
5M NaCl100mM2ml
0.5M EDTA pH 8.010mM2ml
10% SDS  0.5%5ml
精製水100ml へメスアップ

500ulのバッファーに対してProteinase K(20mg/ml)を10ul加えます。

  1. マウスの組織(しっぽや耳)を2mm角ぐらいの大きさに切除し、1.5mlエッペンドルフチューブに入れる。
  2. 上記のバッファーを500ul加える。
  3. 55℃でオーバナイト。
  4. 6M NaCl を250ul加え、ボルテックス。on iceで10分間インキュベートする。
  5. 1000rpmで5分間遠心し、上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。
  6. 650ulのイソプロパノールを加え、よく撹拌する。室温で15分静置。
  7. 14000gで15分間遠心し、上清を捨てる。
  8. エッペンドルフチューブの蓋を開けて、5-10分程度乾燥させる。
  9. 100ulのTEバッファーを加え、55℃で10分インキュベートする(DNAが溶けない場合は優しくピペッティングする)。

もう少しきれいなDNAが欲しい場合には、ここからさらにフェノクロエタ沈をすると良いと思います。

他のDNA精製法との比較

DNAの精製度としては

NaOH法 < Proteinase K 法 < カラム法

ですが、コストも

NaOH法 < Proteinase K 法< カラム法

の順で高くなります。

カラム法で抽出したDNAでないとPCRがかからなかったり、逆に、NaOHで抽出したDNAでもきれいにPCRがかかったりすることがあります(プライマーやポリメラーゼの性能などにも左右されます)。

もしもPCRがかかりにくい場合はコストを考えながらDNA精製度を上げると上手くいくことがあります。

NaOHを使った未精製DNA抽出法は下記のリンクをご覧ください。

このサイトでは他にも色々な実験プロトコールや試薬の作り方についてまとめています。

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